pcr中datp作用,pcr技术中datp,dttp的作用

2023-06-17 阅读 608 评论 0

摘要：pcr技术中datp,dttp的作用dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写。是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,dUT

pcr技术中datp,dttp的作用

dNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写。是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,dUTP等在内的统称，"d"指deoxidize，deoxy-，脱氧；"N"代指含氮碱基，代表A、T、G、C、U等中的一种；TP指triphosphate，三磷酸盐。dNTP在生物DNA、RNA合成中，以及各种PCR（RT-PCR、Real-time PCR）中起原料作用。

pcr技术中dntp的作用

PCR技术原理和操作

PCR技术是指，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

一、PCR技术的基本原理和操作

1、PCR反应的成分和作用

总体积：一般为25μl～100 μl

（一）Mg2+:终浓度为1。5～2。0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2+与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会YZTaq酶的活性。 Mg2+能影响反应的特异性和产率。

（二）无Mg2+buffer：由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会YZDNA聚合酶活性。

（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7。0～7。5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。

（五）Taq酶：能耐95℃高温而不失活，其Z适pH值为8。3～8。5，Z适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2+浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0。5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有YZ作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶YZ剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

（七）引物：引物浓度一般为0。1～0。5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基Z好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。

引物G+C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

2、PCR反应步骤和反应条件选择（影响因素）

a、变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。

b、退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G+C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

c、延伸：延伸温度应在Taq酶的Z适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。

以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加

dtt在pcr中作用

血痕的DNA分析目前已成为常规技术，技术的关键在于DNA的提取及定量。有机溶剂法提取的DNA纯度较高，基本提取步骤为：剪碎血痕，置于1.5ml离心管中，加400 μ l提取缓冲液（10mmol／LTris，10mmol／LEDTA，10mmol／L Na Cl，39mmol／L DTT，2%SDS）及10 μ l蛋白酶K（20mg／ml），56℃过夜。血痕及其他法医物证检材中常有杂质存在，可抑制PCR扩增。

使用时用特制打孔器截取直径约1.2mm的血痕置于塑料试管中，用FTA纯化缓冲液洗涤三次，TE漂洗两次

在pcr反应中,datp在扩增中可以提供能量吗

的原理

　　5’RACE与3’ RACE略有不同。首先，引物多设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT；其次，在酶促反应中增加了逆转录和加尾步骤，即先用GSP-RT逆转录 mRNA获得第一链(-)cDNA后，用脱氧核糖核酸末端转移酶和dATP在cDNA5’ 端加poly(A)尾，再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,接下来与3’ RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物(5amp)进行PCR扩增。

datp dttp dctp dgtp总称

dATPdGTPdTTPdCTP这四种都是脱氧核糖核苷酸，都是合成DNA的原料。同时，它们所携带的高能磷酸键，也可以为反应提供能量。

dctp datp dgtp dttp在PCR中的作用

引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。

引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补。

所有的DNA复制都是从一个固定起点开始的，而且目前所知的DNA聚合酶都只能延长DNA链而不能从头合成DNA链。DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3’末端开始合成新的DNA链。

作用机理：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。

在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

什么是dATP

末端终止法测DNA序列即SANGER双脱氧链终止法,其原理是:

DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争。

产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。